HERRAMIENTAS II

MODELAMIENTO DE PROTEÍNAS

            El DNA contiene la información para la fabricación de proteínas, que son las moléculas que llevan a cabo las actividades vitales en la célula. A diferencia del DNA, que tiene una única estructura y sus funcionalidad depende en mayor medida de su secuencia, las proteínas no son capaces de realizar su papel si no se pliegan adecuadamente, dando origen a la estructura secundaria y terciaria. La estructura terciaria representa la forma funcional de la proteína, capaz de integrarse con otras proteínas y de llevar a cabo múltiples tareas.

            La caracterización funcional de la secuencia de proteínas es básica para resolver muchos problemas de biología. Esto se consigue gracias a un modelo tridimensional (3-D) agudo de la estructura de interés. Usualmente, la estructura de una proteína se determina por medio de cristalografía de rayos X, o por espectroscopia NMR, que se almacenan en la base de datos Protein Data Bank (PDB).

En la ausencia de una estructura determinada experimentalmente, el modelamiento comparativo, o por homología, puede proveer un modelo 3-D útil, relacionado al menos con una estructura conocida. El modelamiento por homología predice la estructura 3-D de una secuencia proteína dada (proteína objetivo), basado en su alineamiento a una o más proteínas de estructura conocida (proteína molde). El proceso consta de 4 pasos básicos: identificación de las posibles proteínas-molde, alineamiento proteína-problema y proteína(s)-molde, construcción del modelo y evaluación del mismo. La cantidad de secuencias de proteína que pueden ser modeladas con gran exactitud se ha incrementado, gracias al aumento de estructuras determinadas experimentalmente.

A pesar del progreso en la predicción de estructuras proteínicas por ab initio (basado en intuir el plegamiento proteico mediante el calculo de las fuerzas de atracción entre moléculas de aminoácidos, sin ninguna comparación con estructuras conocidas), el modelamiento por homología es más confiable para el diseño de modelos 3-D, cuya agudeza puede compararse a la que se logra con experimentación de baja resolución. Incluso, modelos con errores son útiles ya que algunos aspectos de la funcionalidad de la proteína pueden determinarse de acuerdo a ciertas características estructurales.

Figura 59. Pagina principal del programa Swiss-Pdb Viewer. 

Este programa es necesario descargarlo desde el sitio Web e instalarlo en el computador. Para ello se hace clic en la opción DOWNLOAD del menú de la izquierda de la página principal (Figura 59), con lo cual se abre una sección donde se debe aceptar un contrato de licencia haciendo clic en el enlace I AGREE AND WANT TO DOWNLOAD SWISS PDB VIEWER NOW (en la parte inferior) (Figura 60). Luego, se abre una ventana donde tenemos la opción de elegir el sistema operativo de nuestro computador (Figura 61), y al realizar esta acción se abre una página donde se procede a la descarga e instalación del software (Figura 62) en forma similar a la descrita en el apartado descarga de programas de bioinformática.

Figura 62. Pagina de descarga e instalación del software Swiss-Pdb Viewer.

               Figura 63. Ventanas de presentación y de funciones del programa Swiss Pdb Viewer. La ventana de la parte inferior tiene la presentación del programa, la de la parte superior contiene la parte operativa del software.

Realizar un modelo 3-D de una proteína es una tarea compleja, que incluso algunos lo han catalogado de “arte”, lo cual implica el conocimiento profundo de la secuencia y de los objetivos que se persigan. Por ello, no se puede generalizar en reglas de diseño ya que cada caso debe abordarse de una manera diferente. En este apartado se expone algunos pasos básicos para iniciar el modelo.

- Se guarda en una carpeta la secuencia de la proteína-problema, dentro de un archivo FASL.txt (Figura 64), lo cual se realiza con el block de notas en el sistema operativo Windows.

               Figura 65. La secuencia de la proteína-problema una vez ingresada al programa Swiss-Pdb Viewer. La segunda ventana contiene la secuencia como una alfa-hélice, en la ventana inferior se encuentran la secuencia de aminoácidos.

               - Luego, se elige el ítem SWISS-MODEL del menú PREFERENCES" y en la ventana emergente se escribe el nombre del investigador y correo electrónico y se hace clic en OK.

            - Ahora se procede a escoger la opción FIND APPROPRIATE EXPDB TEMPLATES del menú SWISSMODEL, lo cual abrirá una ventana del navegador de Internet que mostrará la secuencia de la proteína problema. Aquí se hace clic en SUBMIT. Esta acción enviará la secuencia al servidor que retornará las opciones de secuencia de proteína-molde más adecuadas en una nueva página del navegador (Figura 66).

Figura 66. Lista de las posibles secuencias de proteína-molde para realizar el alineamiento con la secuencia de la proteína-problema.

- De la lista de posibles secuencias de proteína-molde se escoge las opciones más convenientes, principalmente de acuerdo al porcentaje de identidad, para realizar el modelamiento. Para este fin, se hace clic en el nombre de estas (Figura 66). Una vez hecho esto se abre una ventana del computador que le solicita indicar la carpeta (Mis documentos o carpeta personal) donde se debe guardar estas secuencias.

- Acto seguido, se ingresa las secuencias de proteína-molde elegidas al programa por medio del menú FILE en la opción OPEN PDB FILE, lo cual abrirá una ventana del navegador que solicitara indicar la carpeta donde se guardo las secuencias de proteína-molde. Una vez se haya hecho esto, aparecerán las estructuras 3-D al lado de la alfa-hélice de la secuencia de proteína-problema, y en la ventana de alineamiento se podrá observar la secuencia de aminoácidos de estas (Figura 67).

Figura 67. Secuencias de proteína-problema (alfa-hélice) y proteína-molde (3-D) una vez se han ingresado en el programa. En la ventana de alineamiento se encuentran las 3 secuencias de aminoácidos antecedidas por sus nombres, en rojo el nombre de la secuencia de la proteína-problema. 

- En la ventana de alineamiento se hace clic sobre el nombre de la secuencia de proteína-problema, y luego se da un clic en el marco superior de la ventana, donde se encuentra la alfa-hélice acompañada de las estructuras 3-D de las secuencias de proteína-molde. Una vez realizada esta acción se oprime ENTER en el teclado, con lo que la alfa-hélice desaparecerá.

- Después se hace clic en la secuencia de proteína-molde que se desea sea utilizada como base del alineamiento (en la ventana de las estructuras 3-D deberá aparecer el nombre de esta secuencia). Acto seguido se elige el ítem MAGIC FIT del menú FIT, se abrirá una caja de dialogo indicando que una secuencia de proteína-molde funcionará como referencia y la otra como base, se da clic en OK.

- Se continúa con la opción GENERATE STRUCTURAL ALIGNMENT del menú FIT, con lo cual se realizará el alineamiento estructural (Figura 68).

-  A continuación, se hace clic en el nombre de la secuencia de proteína-problema en la ventana de alineamiento para luego elegir la opción UPDATE THREADING NOW del menú SWISS-MODEL (este ítem no es accesible si la opción UPDATE THREADING DISPLAY AUTOMATICALLY esta activa, en cuyo caso es necesario desactivarla).

-  Ahora se active la opción UPDATE THREADING DISPLAY AUTOMATICALLY del menú SWISS-MODEL, con lo cual la secuencia de proteína-problema se alineará alrededor de la secuencia de proteína-molde de referencia.

- Las secuencias se pueden colorear por medio del menú COLOR y el ítem BY OTHER COLOR, previamente haciendo clic en el nombre de la secuencia que se desee colorear en la ventana de alineamiento.

                    Figura 68. Alineamiento estructural de la secuencia de proteína-problema con las secuencias de proteína-molde. La secuencia de proteína-problema esta en verde, en rojo y azul se presentan las secuencias de proteína-molde.

·         Ahora se procede a enviar el modelo para su validación al servidor de Swiss Model por medio del ítem SUBMIT MODELLING REQUEST del menú SWISS-MODEL y siguiendo las instrucciones. Por medio del correo electrónico suministrado se recibirá la respuesta (esto dura aproximadamente de 5 a 10 minutos).

·         Todo el proceso de modelamiento implica estar conectado a Internet.

            El programa tiene muchas opciones para modelar, analizar, reformar y evaluar los modelos realizados, que deberán utilizarse de acuerdo a cada caso. La página de este software tiene una guía de usuario, un tutorial básico y además de un enlace hacia un tutorial preparado por el profesor Gale Rhodes del departamento de química de la Universidad de Southern Maine  (http://www.usm.maine.edu/~rhodes/SPVTut/index.html), el cual aconsejo estudiar minuciosamente afin de conseguir un mayor provecho de las ventajas del programa. 

            2. Modelamiento por homología de proteínas-Servidor Robetta (http://www.robetta.bakerlab.org): Este servidor provee herramientas automatizadas para la predicción de estructura de proteínas y su análisis. Para la predicción de estructuras, las secuencias son enviadas al servidor donde se arreglan en dominios y modelos estructurales usando los metodos de modelamiento comparativo o predicción de estructuras de novo. Si se da un apareamiento confiable de la secuencia problema a una proteína de estructura conocida por medio de BLAST, PSI-BLAST, FFAS03 o 3D-JURY, esta se usa como molde para la construcción de un modelo por homología. Si no se da un apareamiento con ninguna estructura proteíca conocida, la predicción del modelo se realiza usando el metodo de novo inserción del fragmento Rosetta. Asimismo, se pueden enviar datos experimentales obtenidos de Resonancia Magnetica Nuclear (NMR), con la secuencia problema para la determinación de la estructura por RosettaNMRdenovo. El sitio incluye la predicción de efectos de mutaciones en interacciones proteícas. Para su utilización adecuada es necesario registrarse para lo cual es necesario poseer un correo electrónico perteneciente a una institución educativa (simbolizado por EDU en la dirección, ejemplo xxx@universidad.edu.co).